SiDoTek™ One Step Cloning Kit

一步法多片段無縫克隆試劑盒

目錄號(hào)：SDMR4-2a

儲(chǔ)存條件：-30 ~ -15℃保存1年，≤0℃運(yùn)輸

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

SiDoTek™ One Step Cloning Kit是一款簡(jiǎn)單、快速、高效的DNA定向克隆試劑盒，可以將插入片段定向克隆至任意載體的任意位點(diǎn)。可以高效兼容1-5個(gè)片段同源重組，50℃反應(yīng)10 - 30 min即可進(jìn)行連接，適用于快速克隆，DNA定點(diǎn)突變等。

產(chǎn)品內(nèi)容

注意事項(xiàng) 

1. 請(qǐng)于使用前確保產(chǎn)品完全解凍，徹底混勻后短暫離心，置于冰上備用。

2. 反復(fù)凍融會(huì)影響產(chǎn)品的性能。

3. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

實(shí)驗(yàn)流程

1 制備線性化載體

  選擇合適的克隆位點(diǎn)，并對(duì)載體進(jìn)行線性化。盡量選擇無重復(fù)序列且載體克隆位點(diǎn)上下游20bp區(qū)域內(nèi)GC含量在40%-60%之間的位點(diǎn)進(jìn)行克隆。載體線性化方式主要有：限制性內(nèi)切酶酶切消化和反向PCR擴(kuò)增兩種。

1）限制性內(nèi)切酶酶切制備線性化載體時(shí)，推薦使用雙酶切方案。盡管單酶切線性化并不影響無縫鏈接，但可能會(huì)有更多的環(huán)狀質(zhì)粒殘留，增加后期克隆的篩選難度。

2）反向PCR擴(kuò)增制備線性化載體時(shí)，必須使用高保真DNA聚合酶進(jìn)行載體擴(kuò)增，以減少擴(kuò)增突變的引入。PCR產(chǎn)物需要進(jìn)行膠回收，減少環(huán)狀質(zhì)粒（環(huán)狀DNA模板）的殘留。

2 制備插入片段

  通過在插入片段正、反向引物5^，端，引入15-25bp線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5^，端和3^，端的末端分別帶有與線性化載體的兩個(gè)末端對(duì)應(yīng)的完全一致的序列。使用高保真PCR Mix完成擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，并回收正確的產(chǎn)物片段。

  插入片段正向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式：

  5’-上游載體末端同源序列+酶切位點(diǎn)（保留或刪除）+基因特異性正向擴(kuò)增引物序列-3’

  插入片段反向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式：

  3’-基因特異性反向擴(kuò)增引物序列+酶切位點(diǎn)（保留或刪除）+下游載體末端同源序列-5’

3 線性化載體與插入片段濃度測(cè)定

使用NanoDrop超微量生物檢測(cè)儀或Qubit，檢測(cè)線性化載體和插入片段的濃度。

4 重組反應(yīng)體系的配制

1）線性化載體和插入片段使用量計(jì)算

載體與插入片段摩爾比為1:2 ~ 1:3；當(dāng)插入片段長(zhǎng)度大于克隆載體時(shí)，將插入片段當(dāng)作克隆載體，克隆載體當(dāng)作插入片段計(jì)算。

2）在冰上配制10μL反應(yīng)體系：

3） 使用移液器輕輕吸打混勻并瞬時(shí)離心。

4） 50℃反應(yīng) X min， 4℃維持或取出后置于冰上冷卻。（其中，X 代表不同數(shù)量插入片段的參考反應(yīng)時(shí)間。當(dāng)插入1個(gè)片段時(shí)，反應(yīng)條件為50℃，5min；當(dāng)插入片段數(shù)為2,3,4,5,6個(gè)時(shí)，建議反應(yīng)條件為50℃，對(duì)應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間分別是10 min,20 min,30 min,40 min,50min。超長(zhǎng)載體片段連接時(shí)，建議反應(yīng)時(shí)間為40-60min。）

5） 重組反應(yīng)轉(zhuǎn)化、涂板，具體方法參照感受態(tài)細(xì)胞的說明書。