SiDoTek™ First Strand cDNA Synthesis Kit (with dsDNase)   

第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒（含雙鏈特異性DNA酶）

目錄號：SDMR2-2a

儲存條件：-30 ~ -15℃保存2年，≤0℃運(yùn)輸

產(chǎn)品內(nèi)容：

產(chǎn)品簡介

SiDoTek™ First Strand cDNA Synthesis Kit (with dsDNase)是一款含有基因組去除組分的第一鏈cDNA合成試劑盒，可高效去除RNA中的基因組DNA污染。試劑盒中包含合成高質(zhì)量第一鏈 cDNA所需的所有成分，產(chǎn)物可作為模板適用于后續(xù)的PCR、qPCR等實(shí)驗(yàn)。5×RT Buffer 中包含優(yōu)化的緩沖體系和dNTP；10×Enzyme Mix中包含 Heat-stable Reverse Transcriptase和RNase inhibitor。本試劑盒采用的Oligo (dT)₂₃ VN比傳統(tǒng)的Oligo (dT)₁₈對于Poly A+ mRNA的錨定能力更強(qiáng)，使得逆轉(zhuǎn)錄效率更高。用戶可根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體需要，自行選擇Oligo (dT)₂₃ VN、Random Primers N6或基因特異引物作為逆轉(zhuǎn)錄引物。當(dāng)模板是帶Poly A尾的真核生物mRNA和一些帶Poly A尾的病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄引物可以選擇Oligo(dT)₁₈(0.5 μg /μl)。原核生物或者不帶Poly A尾的病毒mRNA無法使用Oligo dT 作為引物，因此反轉(zhuǎn)錄引物只能選擇Random Primer N6(0.1 μg/μl)。

適用范圍

用于第一鏈cDNA合成。可用于高拷貝、低拷貝基因的檢測。也可用于cDNA片段長度12 kb 以內(nèi)的合成。

注意事項(xiàng)

1. 操作過程嚴(yán)格避免RNase污染。為保證反轉(zhuǎn)錄成功，建議使用高質(zhì)量的RNA樣品。

2. 為避免樣品間交叉污染和氣溶膠污染，推薦在超凈臺或生物安全柜中進(jìn)行反應(yīng)體系的配制,并使用帶濾芯的吸頭。

3. 注意：5× gDNA Eraser Mix 、5× RT MasterMix非常粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸頭外導(dǎo)致?lián)p失，用前請離心后再使用，并且避免試劑在吸頭外壁沾附而造成大量損失。

4.請于使用前確保產(chǎn)品完全解凍，徹底混勻后短暫離心，置于冰上備用。反復(fù)凍融會影響產(chǎn)品的性能。

5.為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

實(shí)驗(yàn)流程 （以20 μL反應(yīng)體系為例）

推薦的基因組DNA去除體系

用移液器輕輕吹打混勻，37℃反應(yīng)2min，立即置于冰上，或者繼續(xù)55℃反應(yīng)5min后置于冰上。（55℃反應(yīng)5min能充分失活dsDNase，后續(xù)加入的5× RT Buffer中含有DTT也能抑制dsDNase的活性）

配制第一鏈cDNA合成反應(yīng)體系

使用移液器輕輕吹打混勻。

*Oligo d(T)23 VN 與 Random Primers N6 同時使用效果更好

如用Oligo(dT)₂₃ VN 或基因特異引物(GSP)時，

按下列反應(yīng)條件進(jìn)行第一鏈cDNA合成

*如果模板具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)或高GC區(qū)域，可將反應(yīng)溫度提高到55℃，有助于提高產(chǎn)量。

如用Random Primers N6 時，按下列反應(yīng)條件進(jìn)行第一鏈cDNA合成

*如果模板具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)或高GC區(qū)域，可將反應(yīng)溫度提高到55℃，有助于提高產(chǎn)量。

得到的cDNA產(chǎn)物可立即用于PCR或qPCR反應(yīng)，或在-20℃保存，并在半年內(nèi)使用，長期存放建議分裝后在-80℃保存。做qPCR時，建議取1/10 ~ 1/5 體積(即2 ~ 4 μl)的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為PCR模板。豐度高的可以酌情適當(dāng)稀釋cDNA后使用。cDNA應(yīng)避免反復(fù)凍融。