SiDoTek™ Fast Pfu DNA polymerase 

快速高保真DNA聚合酶

 

目錄號：SDMR1-2a

儲存條件：-30 ~ -15℃保存2年，≤0℃運輸

濃度：5U/μL

 

產(chǎn)品內(nèi)容：

 

產(chǎn)品簡介

普通Pfu聚合酶擴增能力差、延仲速度緩慢(0.5kb/min)、擴增產(chǎn)量低，給眾多實驗者帶來不便。Fast Pfu DNA Polymerase是經(jīng)基因工程改造獲得的新一代高保真DNA聚合酶，用于快速PCR擴增。與Pfu酶相比，Fast Pfu DNA Polymerase在保持高保真性的同時，兼具有合成DNA速度快(2~3kb/min,是普通Pfu酶的4~6倍)，抗干擾能力強以及PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量獲得方面有較顯著的提升。本產(chǎn)品適用于有高保真要求的PCR擴增反應，尤其在復雜模板擴增，平端克隆，基因定點突變，長片段擴增，全基因合成等方面具有優(yōu)秀的表現(xiàn)。

 

產(chǎn)品特色

快速擴增:Fast Pfu Polymerase 擴增速度在72℃保溫15秒即可延伸 1kb左右。

高靈敏度:對模板DNA需求量較普通Pfu酶低?？蓮?/span>0.05 ng人基因組DNA模板中擴增出1.2kb特定基因片段。

強擴增能力:以λDNA為模板，擴增長度可達12kb，能高效擴增≤6kb片段。

高保真性:具有與Pfu酶相同的保真度。

 

應用范圍

常規(guī)PCR

基因的高保真擴增、克隆和表達

基因的定點突變

細胞內(nèi)基因突變分析

 

活性定義

1單位(U) Fast Pfu DNA Polymerase 活力定義為：在72℃ 30分鐘內(nèi)，將10 nmol 同位素標記的 4x dNTP 摻入到酸不溶物質(zhì)中所需酶的量。

 

酶貯存液

20 mM Tris-HCl (pH8.0), 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1%Tween-20(v/v),

50% Glycerol(v/v),Stabilizers。

 

注意事項

1. 其擴增產(chǎn)物為平端可直接克隆于平端載體中，但不能直接用T/A克隆方式克隆。

2. 請于使用前確保產(chǎn)品完全解凍，徹底混勻后短暫離心，置于冰上備用，反復凍融會影響產(chǎn)品的性能。

3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

 

使用建議

Fast Pfu DNA聚合酶產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物為平滑末端，無3'端"A"突出，其PCR產(chǎn)物的克隆有兩種方案:

1、PCR引物進行5'端加磷酸修飾或將PCR產(chǎn)物磷酸化處理后再直接克隆于平滑末端的載體中。

2、將產(chǎn)物3'末端加A后再與T載體連接。

由于Fast Pfu DNA聚合酶的校對活性可引起引物從3'端被部分降解。因此在設計引物時應適當增加引物的長度，理想的引物長度為20-30bp 堿基。另外為了減少由3'-5'外切酶活性引起的引物降解，盡量在冰上配制反應體系。

 

PCR反應液組成（50μL）

試劑	體積
Fast Pfu DNA Polymerase （5U/μL ）	0.5 μL
10×HiFi Buffer（Mg2+ free）	5 μL
25 mM MgCl2	X μL*
dNTP (10mM)	1 μL
正向引物 (10μM)	1~2 μL*
反向引物 (10μM)	1~2 μL*
模板DNA	Y ng*
DNase-Free Water	up to 50 μL

*推薦引物終濃度為 0.2~0.4 μM，效果不佳時也可在0.1~1μM間進行調(diào)整。

*對于大多數(shù)PCR反應，Mg²⁺推薦濃度為1.5~2.5 mM；可用25 mM MgCl₂以0.5 mM為間隔摸索Mg²⁺最佳使用濃度。

*基因組DNA推薦用量為10~400ng，模板為質(zhì)?；虿《?/span>DNA時，推薦用量為10pg~20ng。

 

PCR反應條件

95℃	3~5 min	預變性
95℃	15 sec
58℃	20 sec	30-35cycles
72℃	2~3kb/min
72℃	5 min	終延伸

* 退火溫度需要根據(jù)引物的 Tm 值進行調(diào)整，一般設置成低于引物 Tm 3~5℃。