上一期介紹了熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及相對(duì)定量?jī)煞N方法案例分析（【從RNA提取到qPCR】qPCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及案例分析），本期我們繼續(xù)為大家提供滿滿的干貨——定量數(shù)據(jù)有效性分析和常見問題解決策略。

熒光定量數(shù)據(jù)有效性分析

判斷數(shù)據(jù)的有效性，可以結(jié)合擴(kuò)增曲線，溶解曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線以及NTC（檢驗(yàn)引物）和NRC（檢驗(yàn)?zāi)０澹﹣?lái)分析。

擴(kuò)增曲線應(yīng)呈現(xiàn)出平滑的S型曲線，起始無(wú)擴(kuò)增，起峰時(shí)間正常，由擴(kuò)增曲線得到的Ct值是判斷實(shí)驗(yàn)成功與否的重要參考，Ct值有一定的可信范圍，臨床檢驗(yàn)小于33，科學(xué)研究小于38，內(nèi)參基因一般小于20，且樣品間內(nèi)參的Ct值差不超過1，表明內(nèi)參基因表達(dá)量穩(wěn)定，復(fù)孔Ct值標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過0.5；

溶解曲線應(yīng)呈現(xiàn)單峰，峰的寬度較小，NTC和NRC無(wú)特異的峰出現(xiàn)；

標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率范圍-3.58~-3.10，對(duì)應(yīng)引物的擴(kuò)增效率范圍90%~110%，R²代表線性擬合度，一般大于0.95；

NTC用于判斷反應(yīng)是否存在模板污染，引物是否特異，是否會(huì)形成引物二聚體。NTC最佳狀況是沒有擴(kuò)增，即擴(kuò)增曲線和溶解曲線與基線重合，沒有Ct值。NTC有擴(kuò)增的情況下，至少與加入模板體系的Ct值相差5或10以上；

NRC用于判斷cDNA模板中是否存在基因組DNA殘留，可以間接反映RNA中基因組DNA污染情況，理想情況下，NRC沒有Ct值，有Ct值的話至少要跟加入cDNA模板體系的Ct值相差5或10以上。熒光定量標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)參考范圍見下表格：

熒光定量常見問題解析▲▲▲

下面，我們對(duì)qPCR實(shí)驗(yàn)中常見問題進(jìn)行分析：

        1 Ct值出現(xiàn)過晚（＞38）：

a. 擴(kuò)增效率低 ，反應(yīng)條件不夠優(yōu)化，可以重新設(shè)計(jì)引物或探針、更換靈敏度更高的試劑、改用三步法反應(yīng)，降低退火溫度；

b. 反應(yīng)成分降解或模板量偏低，可以設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、檢查RNA質(zhì)量、提高反轉(zhuǎn)錄效率、采用一步法qRT-PCR；

c. PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)，可以重新設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增長(zhǎng)度建議100-200 bp。

2 無(wú)Ct值或無(wú)信號(hào)：

a. 循環(huán)數(shù)偏少，建議擴(kuò)增循環(huán)數(shù)35以上，可以根據(jù)具體情況增加循環(huán)數(shù)至45；

b. 信號(hào)采集設(shè)置有誤，三步法建議在72℃延伸采集，確定設(shè)置了采集信號(hào)指令；

c. 引物或探針失效，建議設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、探針退火溫度偏低，凝膠電泳檢測(cè)是否存在擴(kuò)增產(chǎn)物；

d. 模板不足或降解，建議檢測(cè)RNA質(zhì)量、提高反轉(zhuǎn)錄效率、避免cDNA反復(fù)凍融、使用探針法；

e. 閾值設(shè)置不正確，閾值建議在指數(shù)期進(jìn)行手動(dòng)調(diào)整。

3 擴(kuò)增曲線S型異常（圖一）：

a. ROX添加不當(dāng)，建議根據(jù)機(jī)型選擇合適的ROX；

b. 模板濃度過高，可以適當(dāng)稀釋模板，減少擴(kuò)增抑制；

c. 基線設(shè)置不正確，基線期起始于3-10個(gè)循環(huán)，終止于指數(shù)擴(kuò)增前，有些機(jī)型可以手動(dòng)調(diào)整。

4  擴(kuò)增曲線平臺(tái)期不平滑（圖二）：

a. 探針或熒光染料品質(zhì)不好；

b. 儀器使用過度，熒光收集不穩(wěn)定；

c. 儀器未經(jīng)過校正（包括自動(dòng)校正或ROX校正)；

d. 體系中抑制物較多，導(dǎo)致熒光不穩(wěn)定。

圖二

模板中抑制物包括多糖類，有機(jī)溶劑，蛋白酶K等，可以參考之前給大家介紹的RNA品質(zhì)檢測(cè)內(nèi)容。一般cDNA中存在抑制物可以在反轉(zhuǎn)錄前對(duì)RNA進(jìn)行梯度稀釋，分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，可以減少或消除抑制物的影響（參見圖三）。

圖三

5擴(kuò)增精密度差（圖四）：

a. 加樣誤差，建議引物和qPCR Mix先預(yù)混，分裝后加模板；

b. 體系配置錯(cuò)誤，仔細(xì)檢查操作步驟；

c. 反應(yīng)液沒有混勻，充分渦旋混勻；

d. 低拷貝基因或模板濃度過高或過低，調(diào)整模板上樣量，cDNA原液加入體積不超過體系總體積1/10；

e. 未引入校正系統(tǒng)，根據(jù)機(jī)器型號(hào)加入ROX。 

圖四

6溶解曲線不是單峰（圖五）：

a. 引物設(shè)計(jì)及用量問題，建議重新設(shè)計(jì)退火溫度較高（58~62℃），無(wú)錯(cuò)配，Blast比對(duì)特異的引物、引物用量合適（0.2~0.4 μM）；

b. 模板有基因組污染，建議優(yōu)化RNA提取方法，選擇合適的反轉(zhuǎn)錄試劑，跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)引物；

c. 基因表達(dá)量低，建議增加反轉(zhuǎn)錄效率，適當(dāng)提高模板量，選用一步法qRT-PCR；

d. 擴(kuò)增體系不佳，可以使用靈敏度高，特異性強(qiáng)，封閉技術(shù)先進(jìn)的試劑。

圖五

7標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳（圖六）：

a. 加樣誤差，建議標(biāo)準(zhǔn)品加樣體積大于2微升、引物預(yù)混后再分復(fù)孔，定期校正移液器，盡量選擇硅化槍頭，使用文庫(kù)稀釋液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，降低耗材管壁對(duì)DNA吸附；

b. 標(biāo)準(zhǔn)品降解，應(yīng)該避免反復(fù)凍融、電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)降解后重新制備稀釋標(biāo)準(zhǔn)品；

c. 模板濃度高或有抑制物，可以改變稀釋精度，增加稀釋梯度；

d. 引物或探針不佳，重新設(shè)計(jì)引物和探針； 

e. PCR酶靈敏度不高及活力下降，建議更換靈敏度更高，線性關(guān)系更好的試劑，校正-20℃冰箱，使用時(shí)將酶置于冰上。

圖六

8NTC有擴(kuò)增：

a. 水，試劑或引物污染，可以分裝水和引物，試劑優(yōu)先于引物和模板加入到體系中；

b. 引物二聚體，建議優(yōu)化引物設(shè)計(jì)，提高退火溫度（58~62℃），降低引物濃度（0.2~0.4 μM）；

c. PCR核心酶特異性差，可以選用封閉技術(shù)先進(jìn)（全封閉）的試劑。

9 擴(kuò)增效率低：

a. 反應(yīng)條件不夠優(yōu)化，建議降低退火溫度，使用三步法，使用擴(kuò)增更線性的試劑；

b. PCR抑制物，建議優(yōu)化核酸純化方法，適當(dāng)稀釋模板降低抑制物影響；

c. 引物設(shè)計(jì)，引物避免3’端錯(cuò)配、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在100~200 bp 。