熒光定量PCR引物設計 

qPCR引物設計需遵循一定的方法和原則，如研究的目的基因已經(jīng)有文獻報導，可以使用文章材料和方法中給出的引物進行后續(xù)qPCR實驗；如沒有報導，須先確定目的基因的mRNA序列，有參物種可以直接到GenBank數(shù)據(jù)庫中查到準確的mRNA序列，無參物種須先通過高通量測序測出部分mRNA序列或進一步通過RACE實驗得到全長mRNA序列后再設計引物。

mRNA序列確定后就可以通過軟件來設計引物，推薦使用Primer3、Primer5、MFold等軟件進行設計，通過軟件可以幫助我們分析引物的基本質量，如引物序列中是否存在錯配，二聚體，發(fā)卡結構等，通過軟件設計的引物最終也要進行Blast比對，確保設計的引物在該物種中只能檢測目的基因，保證其特異性。

SYBR染料法引物設計需遵循以下原則：引物長度18～30 bp、產(chǎn)物長度100～400 bp、G/C含量40～60%、避免引物內(nèi)含有互補序列 (尤其是3’端)、避免3’ 端錯配、3’端不能出現(xiàn)連續(xù)三個以上的G或C、避免3’端出現(xiàn)T堿基 、設計跨內(nèi)含子引物。

TaqMan探針及引物需遵循以下原則：TaqMan探針退火溫度比引物高10℃、沒有連續(xù)相同的堿基、探針位置盡可能靠近上游引物、C遠遠多于G、5’ 端沒有G；TaqMan探針法引物設計原則除了包含SYBR染料法所有原則外，需注意5’ 端不要有G，因為G會淬滅發(fā)光基團發(fā)出的熒光。

熒光定量PCR實驗設計 

qPCR實驗設計要確定對照，對照設置包括兩個方面，其中一個方面為陰性對照，重要的陰性對照包括NTC（No template control）和NRC（No reverse transcriptase control），前者檢驗是否有模板污染，具體操作是以水為模板，觀察擴增情況；后者檢驗cDNA中是否有基因組DNA污染，具體操作是在反轉錄的時候多配制一個體系，不加反轉錄酶，其余成分正常添加，經(jīng)歷相同的反轉錄過程，以此為模板，觀察擴增情況。建議以cDNA為模板時，兩個陰性對照同時檢測下，排除模板及基因組DNA污染對定量的影響，如果以基因組DNA為模板，只需進行NTC檢測；

另外一個方面為陽性對照，包括：帶有PCR擴增子的合成的RNA或cDNA寡核苷酸、重組質粒DNA、體外反轉錄的RNA、來自于特定的生物體樣本的RNA或DNA及國際上公認的生物學標準物等。陽性對照可以幫助我們快速判斷失敗的擴增是否是試劑失效或儀器故障導致。

qPCR實驗設計要選擇合適的定量方法，研究基因表達差異最常用的是相對定量，它有兩個重要的方法：△△Ct法和雙標準曲線法。前者特點包括：只依靠Ct值、用于大通量（很多基因，如芯片結果）、計算簡單、估計性的結果、要求目的基因和內(nèi)參基因擴增效率都比較好。后者其實是先做了絕對定量再進行比較，其特點包括：結果精確、對擴增效率要求不高、構建目的基因與內(nèi)參基因的標準品、相當于兩個絕對定量、每次反應都要作標準曲線。

下面我們通過兩個具體的實驗案例來深入了解兩種定量方法的計算過程。

熒光定量PCR案例分析之△△Ct法 

第一個實驗案例是運用△△Ct法進行表達量分析，作者比較病毒刺激細胞后，細胞抗病毒基因ISG54的表達情況差異。實驗樣品包括病毒刺激細胞以及對照細胞。使用的試劑包括RNA提取，反轉錄及SYBR染料法qPCR Mix。

因為是相對定量，涉及比較，因此要選擇內(nèi)參基因進行校正，作者在此案例中選擇了GAPDH作為內(nèi)參基因，設計內(nèi)參和目的基因引物，完成兩個基因在實驗組和對照組模板中的qPCR檢測，統(tǒng)計各基因在兩個模板中的Ct值（參見圖一）。

圖一

利用2^-△△Ct法公式進行定量計算，這個公式包括兩個△Ct，整個計算過程為：先進行第一個△Ct的計算，也就是均一化計算，在每一組模板中使用目的基因的Ct值減去內(nèi)參基因Ct值，△Ct_對照=26.84-18.20=8.64，△Ct_實驗=23.64-18.22=5.42；

再進行第二個△Ct的計算，這一步是比較計算的過程，將每組模板均一化的Ct值與對照組中均一化的Ct值進行相減，此案例中作者選擇對照組細胞作為參照，所得值代入公式，△Ct_實驗-△Ct_對照=5.42-8.64=-3.22，2^-（-3.22）=9.32，計算得出的值即為最終的表達量值，表明ISG54基因在病毒刺激的細胞中表達量提高了9.32倍；

在介紹雙標準曲線法之前，還要補充一點，做絕對定量原始標準品拷貝數(shù)如何計算，以一個腺病毒質粒標準品為例，首先計算質粒標準品的平均分子量MW，MW=總堿基數(shù)×2×330，然后計算拷貝質量，拷貝質量=平均分子量MW/阿伏伽德羅常數(shù)，最后將質粒濃度/拷貝質量得出質粒標準品的拷貝數(shù)。原始質粒標準品拷貝數(shù)得到后，每個梯度稀釋的標準品的拷貝數(shù)都是已知量，將梯度稀釋的標準品質粒進行qPCR檢測，得到不同的Ct值，此時就可以計算出Ct值與拷貝數(shù)對數(shù)之間的線性關系方程，即標準曲線方程Y=-a×LogX+b，將標準曲線的斜率帶入到方程式E=10^(-1/slope)-1就可以計算出引物的擴增效率（參見圖二）。

圖二

熒光定量PCR案例分析之雙標準曲線法

第二個實驗案例是關于雙標準曲線法計算基因的相對表達量，作者利用TaqMan探針法研究ERBB2在正?；蛉橄倌[瘤組織標本中的表達差異，選擇GAPDH作為內(nèi)參基因，利用FAM標記ERBB2探針，用VIC標記GAPDH探針，構建了GAPDH和ERBB2標準品質粒，分別將兩個標準品質粒進行梯度稀釋，將梯度稀釋的標準品質粒和待測樣品同時進行qPCR檢測，得到標準曲線，同時統(tǒng)計內(nèi)參和目的基因在兩個待測樣品中的Ct值（參見圖三）。

圖三

第一步計算將內(nèi)參基因的Ct值代入到內(nèi)參的標曲中，將目的基因ERBB2的Ct值代入到目的基因的標曲中，全部轉換為拷貝數(shù)，第二步計算為在每組模板中，目的基因拷貝數(shù)除以內(nèi)參基因拷貝數(shù)，完成均一化計算，第三步計算為選擇參照物進行比較，作者選擇正常組織模板作為參照，將乳腺腫瘤組織中均一化的拷貝數(shù)除以正常組織中均一化的拷貝數(shù)，得到最終的表達量值1.63，表明ERBB2在乳腺腫瘤組織中表達量相對于正常組織提高了1.63倍（參見圖四）。

圖四

熒光定量PCR參照染料ROX的選擇 

qPCR實驗設計最后補充一點獨立的內(nèi)容，參照染料ROX的選擇，首先，我們要明確它的作用包含以下幾點：

1. 調整非PCR因素造成的誤差，如加樣誤差；

2. 提供較穩(wěn)定的基線；

3. 部分儀器在使用前會使用標準化熒光信號進行校正。

可以看出，ROX使用與否只跟儀器相關，如果qPCR儀能夠自動校正孔間熒光信號差，就不需要添加ROX，否則需要使用ROX進行校正。一般情況下，ABI和安捷倫的儀器需要加ROX，BioRad、Roche、Corbett儀器不需要添加。