上一期介紹了熒光定量PCR與普通PCR的重要差別、qPCR的兩個重要參數(shù)及數(shù)學(xué)原理，接下來繼續(xù)為大家梳理定量方式和定量方法等相關(guān)內(nèi)容。

qPCR常用的定量方式有：SYBR染料法、TaqMan探針法、分子信標(biāo)。

SYBR染料法利用SYBR Green I分子的特點，SYBR Green I 是一種結(jié)合于所有雙鏈DNA（dsDNA）雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料（見圖一）。

圖一

SYBR Green I 只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光，游離的染料分子不發(fā)光，在新合成鏈延伸過程中SYBR Green I 摻入雙鏈中，變性時DNA雙鏈解開，SYBR Green I 游離出來，無熒光，過程參見圖二。SYBR染料法需要注意引物的特異性，因為非特異擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二具體均為dsDNA，所以SYBR染料法只能通過引物來保證特異性，SYBR染料法的優(yōu)點在于簡單且成本較低；

圖二

TaqMan探針法核心是探針分子，TaqMan探針是單鏈DNA，5’端偶聯(lián)發(fā)光基團(tuán)，3’端偶聯(lián)淬滅基團(tuán)，游離的完整探針是檢測不到熒光信號的，發(fā)光基團(tuán)發(fā)出的熒光會被淬滅基團(tuán)吸收淬滅，探針被水解，發(fā)光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)遠(yuǎn)離就可以檢測到熒光信號（見圖三）。

圖三

反應(yīng)開始時，模板鏈經(jīng)熱變性解鏈形成單鏈，TaqMan探針優(yōu)先跟模板鏈退火，引物隨后退火到模板上，之后進(jìn)行鏈的延伸，延伸過程中Taq酶發(fā)揮5’-3’外切酶活性，遇到探針會從5’端逐個堿基切除探針，發(fā)光基團(tuán)會跟淬滅基團(tuán)分開，因此熒光檢測系統(tǒng)可以接收到熒光信號，每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，熒光信號的累積和PCR產(chǎn)物形成是同步的，整個過程參見圖四。TaqMan探針法的特異性除了由引物提供，更由探針分子保證，因其退火溫度更高，所以TaqMan探針法特異性更好，在一個反應(yīng)體系中加入多條探針，可以做多個基因同時檢測。

圖四

分子信標(biāo)類似于TaqMan探針，5’端偶聯(lián)有發(fā)光基團(tuán)，3’端偶聯(lián)淬滅基團(tuán)，游離的探針因互補(bǔ)結(jié)構(gòu)存在形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，發(fā)光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)距離非常近，發(fā)光基團(tuán)發(fā)出的熒光會發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象（FRET），激發(fā)淬滅基團(tuán)后信號衰減（見圖五）。

圖五

qPCR反應(yīng)開始的時候，因體系溫度升高，發(fā)夾結(jié)構(gòu)被破壞打開，分子信標(biāo)莖環(huán)區(qū)跟模板鏈退火，發(fā)光基團(tuán)跟淬滅基團(tuán)分開，因距離較遠(yuǎn)，因此不會發(fā)生FRET，所有可以檢測到熒光信號的變化，新合成鏈會將分子信標(biāo)替換，脫離模板鏈的信標(biāo)分子又重新形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)不再產(chǎn)生熒光信號，整個過程參見圖六。分子信標(biāo)因背景熒光極低及其高的特異性可以做SNP檢測。

圖六

關(guān)于定量方式的選擇，一般情況下，在科研中，絕大多數(shù)定量會選擇便宜且方便的SYBR染料法，對于更嚴(yán)格的定量，可以選擇TaqMan探針法；在醫(yī)療檢驗中，優(yōu)先選擇準(zhǔn)確并且特異的TaqMan探針法。

除此之外以下方面可以作為參考：

SYBR染料法適用：特異性要求不是特別高的反應(yīng)、分子數(shù)（拷貝數(shù)）超過1000的反應(yīng)、探針實驗前進(jìn)行預(yù)實驗、PCR條件非常成熟、無二聚體、無非特異擴(kuò)增；

TaqMan探針法適用：特異性要求較高的實驗、多重PCR（標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)）、SNP檢測、靈敏度要求較高的實驗 。

一步法 VS 兩步法

一步法和兩步法qPCR的區(qū)別在于：兩步法是先完成反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄引物為通用引物，后以cDNA為模板進(jìn)行后續(xù)qPCR檢測；一步法是直接以RNA為模板，在一個反應(yīng)體系中先完成反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄引物為基因特異性引物（GSP），然后直接進(jìn)行擴(kuò)增，得不到cDNA，見圖七。適用范圍的差別在于，一步法適合單個基因多個模板檢測；兩步法適用于多個基因少量模板檢測。

圖七

qPCR定量方法

定量方法包括相對定量和絕對定量，兩者的重要差異在于相對定量的結(jié)果是差異性的結(jié)果，涉及比較；而絕對定量的結(jié)果是一個具體數(shù)值，對于基因表達(dá)量而言是基因的拷貝數(shù)，不涉及任何比較。

 相對定量首先需要確定一個內(nèi)參基因，內(nèi)參基因作用有檢測樣本材料中RNA是否降解、糾正樣本加樣的差異、校正cDNA合成速率差異及校正PCR抑制劑的影響，其本質(zhì)作用是利用內(nèi)參基因的Ct值對目的基因的Ct值進(jìn)行均一化處理，常用的內(nèi)參基因包括GAPDH、β-actin、18S rRNA，使用的時候需要注意其序列必須是物種本身的特異序列，雖然其比較保守，但不同物種也會存在堿基差別。另外，相對定量需要確定參照物，因為涉及比較，參照物選擇不同，所得的定量結(jié)果可能完全相反，經(jīng)常選擇的參照物一般是對照組或未處理組

相對定量實驗方法包括兩種重要方法：

1. ??CT Method：使用內(nèi)參基因定量所研究樣品和參照樣品的目的基因。內(nèi)參基因與目的基因可以同時反應(yīng)，也可以單獨反應(yīng)；

2. 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法：對每個樣品的內(nèi)參基因和目的基因都做絕對定量，求出每個樣品中內(nèi)參基因和目的基因的絕對數(shù)量，然后根據(jù)相對定量的基本公式來求出目的基因的差異表達(dá)。絕對定量需要由標(biāo)準(zhǔn)曲線建立Ct值跟拷貝數(shù)之間的關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線由標(biāo)準(zhǔn)品生成，標(biāo)準(zhǔn)品可以是已知濃度的RNA、質(zhì)?；蚝铣傻墓押塑账徭溕?，定量未知模板時標(biāo)準(zhǔn)樣品和未知樣品必須同時反應(yīng)；

絕對定量首先需要建立Ct值和拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系，即標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)曲需要由標(biāo)準(zhǔn)品生成，標(biāo)準(zhǔn)品中基因序列要與待測樣品中基因序列一致，從而保證引物在兩者中擴(kuò)增效率完全相同，標(biāo)準(zhǔn)品來源可以是質(zhì)粒，純化的PCR產(chǎn)物或者基因組DNA等。標(biāo)準(zhǔn)品在加樣時需要注意體積最好大于2微升，以減少標(biāo)曲誤差，標(biāo)曲是由不同梯度標(biāo)準(zhǔn)品生成，每個標(biāo)準(zhǔn)品梯度建立Ct值與拷貝數(shù)對數(shù)值之間的聯(lián)系，落在標(biāo)曲上的梯度點最好有5個及以上，至少3個點。標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品同時反應(yīng)，將待測樣品檢測的Ct值代入標(biāo)曲后即可換算出待測樣品中基因的拷貝數(shù)。