實(shí)時(shí)熒光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR）是一種研究基因表達(dá)量的重要方法（以下簡(jiǎn)稱為qPCR）。

qPCR的重要特點(diǎn)

qPCR基于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，需要區(qū)分qPCR與普通PCR的重要差別。做普通PCR時(shí)會(huì)將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)核酸染料的染色借助于紫外凝膠成像儀進(jìn)行觀察，最后通過(guò)終產(chǎn)物進(jìn)行定性或者半定量分析（如圖一）；

圖一

而qPCR在反應(yīng)體系中引入了熒光基團(tuán)（染料或者探針），可借助于對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度（見(jiàn)圖二）。

圖二

此可見(jiàn)，兩種方法的重要差別在于研究的對(duì)象不同，普通PCR關(guān)注終產(chǎn)物，qPCR關(guān)注起始模板。

熒光定量PCR儀器工作原理

qPCR儀器的品牌和型號(hào)很多，從原理上分析，包含以下三個(gè)反應(yīng)模塊：激發(fā)光發(fā)射源，接收裝置，PCR反應(yīng)模塊（見(jiàn)圖三）。

由于體系中引入了熒光基團(tuán)，需要激發(fā)光發(fā)射源發(fā)出一定波長(zhǎng)的光線，遇到熒光基團(tuán)會(huì)反射另外一個(gè)波長(zhǎng)的光線，此時(shí)被接收裝置實(shí)時(shí)接收，正是由于qPCR儀器比普通PCR儀器增加了這兩個(gè)模塊，因此，qPCR的耗材比普通PCR的耗材要求更高，其頂蓋的透光性必須良好。在做qPCR時(shí)要注意不要徒手或者戴乳膠手套接觸頂蓋，一定要佩戴PE手套操作，防止雜質(zhì)留在頂蓋上影響熒光信號(hào)的發(fā)射及接收。

圖三

熒光定量PCR重要參數(shù)

qPCR有兩個(gè)重要的參數(shù)，第一個(gè)參數(shù)是擴(kuò)增曲線。圖四為擴(kuò)增曲線表示形式，橫坐標(biāo)代表循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)代表熒光強(qiáng)度或者相對(duì)熒光強(qiáng)度。反應(yīng)開(kāi)始時(shí)，熒光信號(hào)不穩(wěn)定，呈現(xiàn)波動(dòng)狀態(tài)，隨后信號(hào)會(huì)趨于穩(wěn)定并且呈現(xiàn)指數(shù)性增長(zhǎng)，到達(dá)一定循環(huán)數(shù)之后，熒光信號(hào)強(qiáng)度不再增加，持續(xù)穩(wěn)定。擴(kuò)增曲線展現(xiàn)出來(lái)為一條S型曲線，包括：基線期，指數(shù)擴(kuò)增期，平臺(tái)期。反應(yīng)完成后，qPCR儀會(huì)以基線期熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍生成一條閾值線，閾值線與擴(kuò)增曲線產(chǎn)生交點(diǎn)，交點(diǎn)對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)代表Ct值，Ct值的含義代表每一個(gè)反應(yīng)體系中熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到閾值時(shí)經(jīng)歷的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，其本質(zhì)不難看出就是循環(huán)數(shù)，它是熒光定量中唯一用于后續(xù)計(jì)算的數(shù)值，是后續(xù)定量計(jì)算的基礎(chǔ)。

圖四

圖五同為擴(kuò)增曲線，作者完成個(gè)96個(gè)獨(dú)立的qPCR反應(yīng)，可以看出，盡管平臺(tái)期不相同，但是在指數(shù)擴(kuò)增前生成的閾值線，得到的96個(gè)Ct值幾乎一致，表明96個(gè)反應(yīng)體系中模板量幾乎一致，體現(xiàn)了Ct值具有重現(xiàn)性這一重要特性，闡明以起始模板量為研究對(duì)象的qPCR定量是非常準(zhǔn)確的，而以終產(chǎn)物為研究對(duì)象的普通PCR，因?yàn)榻?jīng)歷了整個(gè)PCR過(guò)程的指數(shù)性放大，其定量的準(zhǔn)確性受到了限制。擴(kuò)增曲線可以幫助判斷反應(yīng)的完整性，完整的擴(kuò)增應(yīng)該包含之前介紹的三個(gè)時(shí)期。

圖五

第二個(gè)重要參數(shù)是溶解曲線。溶解曲線在反應(yīng)完成之后進(jìn)行檢測(cè)，反映溫度和熒光值之間的關(guān)系，只有染料法才可以進(jìn)行溶解曲線檢測(cè)，探針?lè)ㄒ蛱结標(biāo)夂蟛荒苓€原，故不能做溶解曲線分析。下面兩張圖都是溶解曲線，圖六為原始數(shù)據(jù)，可以看出，隨著溫度升高，DNA雙鏈會(huì)逐漸解開(kāi)，結(jié)合的染料會(huì)釋放出來(lái)，因此熒光信號(hào)會(huì)逐漸下降，到達(dá)一定溫度范圍，熒光信號(hào)出現(xiàn)跌落，進(jìn)一步升高反應(yīng)溫度，因體系中均為單鏈DNA，故熒光值不再發(fā)生明顯變化。

圖六

對(duì)整個(gè)過(guò)程進(jìn)行求導(dǎo)后，得到圖七展示的我們比較熟悉的溶解曲線圖，緩慢下降及最終的熒光信號(hào)穩(wěn)定不再下降求導(dǎo)后為直線，急劇跌落求導(dǎo)后為峰值，因此一個(gè)峰對(duì)應(yīng)一次熒光信號(hào)的跌落，每次跌落代表在這個(gè)溫度范圍內(nèi)有一個(gè)雙鏈產(chǎn)物被大量解鏈，因此單峰代表只有一個(gè)特異產(chǎn)物，多于一個(gè)峰代表存在非特異擴(kuò)增產(chǎn)物或者引物二聚體，溶解曲線幫助我們判斷的是反應(yīng)的特異性?？偨Y(jié)一下，通過(guò)擴(kuò)增曲線和溶解曲線分析，只有完整而且特異的反應(yīng)，Ct值才真實(shí)可信，才可以使用Ct值去進(jìn)行后續(xù)的定量計(jì)算。

圖七

熒光定量PCR數(shù)學(xué)原理

要理解為什么可以用循環(huán)數(shù)本質(zhì)的Ct值去進(jìn)行定量計(jì)算，必須基于一定的數(shù)學(xué)原理。定義初始模板量為X₀，第n次循環(huán)之后產(chǎn)物量為Xn，理想PCR反應(yīng)，Xn=X₀×2ⁿ，非理想PCR，我們定義引物擴(kuò)增效率為Ex，Xn=X₀×（1+Ex）ⁿ，兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)，將Ct值和達(dá)到Ct時(shí)產(chǎn)物的量X(Ct)代入整理的公式，lg X₀= (- lg(1+Ex) ) ×C(t)+ lg Xc(t)這個(gè)最終的方程表明初始模板濃度的對(duì)數(shù)與Ct值呈線性關(guān)系，正是線性關(guān)系的存在，所以我們可以用Ct值來(lái)進(jìn)行后續(xù)表達(dá)量的計(jì)算，它是進(jìn)行計(jì)算的基本數(shù)學(xué)原理。

熒光定量PCR國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)

最后，推薦一篇發(fā)表在臨床化學(xué)上的文章，The MIQE Guidelines。它提出發(fā)表文章時(shí)所要求的最低限度的必要信息標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)文章對(duì)qPCR的術(shù)語(yǔ)、概念、研究與臨床應(yīng)用、樣本的采集、處理和制備、核酸的質(zhì)量控制、反轉(zhuǎn)錄、qPCR過(guò)程及數(shù)據(jù)分析等方面的操作標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范都做了詳盡的闡述。