1970年Baltimore, D. 和Temin, H. M.等學(xué)者發(fā)現(xiàn)了反轉(zhuǎn)錄酶，證明遺傳信息不僅由DNA到RNA，也可由RNA到DNA ，這一發(fā)現(xiàn)對(duì)分子生物學(xué)的中心法則進(jìn)行了修正和補(bǔ)充。 

反轉(zhuǎn)錄就是反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，合成cDNA的過程。

一．反轉(zhuǎn)錄酶的概述

1反轉(zhuǎn)錄酶的酶學(xué)特性

具有依賴于DNA或 RNA模板的DNA聚合酶活性， 反轉(zhuǎn)錄酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此沒有校正功能，所以由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的DNA出錯(cuò)率比較高。

具有降解DNA:RNA雜合雙鏈中RNA的RNase H活性；

DNA聚合酶活性和RNase H活性均為病毒復(fù)制循環(huán)所必需。這兩個(gè)活性中心在結(jié)構(gòu)上是相互獨(dú)立、單獨(dú)折疊的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，在反轉(zhuǎn)錄酶上的相對(duì)位置固定。其中，DNA 聚合酶結(jié)構(gòu)域位于N端，RNase H結(jié)構(gòu)域位于C端；

2反轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)構(gòu)研究

Kohlstaedt L A等研究者于1992年在Science上發(fā)表一篇報(bào)道，提出了HIV-1 RTase的右手結(jié)構(gòu)模型，其中“手指”是與合成中引入的脫氧核苷酸相互作用，“拇指”是與模板相互作用，“手掌”是催化磷酸轉(zhuǎn)移。

3 DNA聚合酶活性

DNA聚合酶活性的持續(xù)合成能力是指RT酶與引物/模板結(jié)合，延伸，解離這樣一個(gè)循環(huán)所能摻入的核苷酸的平均數(shù)目；RTase的持續(xù)合成能力比較低 ，通常條件下小于1 kb；所以要繼續(xù)鏈的延伸，必需有RTase分子重新結(jié)合到引物/模板復(fù)合物上 。

DNA聚合酶活性的保真性是比較低的，RT酶錯(cuò)配率是10^-6～10^-4，而宿主DNA聚合酶錯(cuò)配率是10^-11～10^-7，這主要是由于RT酶缺乏5’-3’和3’-5’外切酶活性。

4 RNaseH活性

RNase H活性為病毒生命周期中復(fù)制循環(huán)所必需；可以降解DNA:RNA雜交鏈上的RNA； RNase H活性限制了RT酶的合 成長(zhǎng)度；我們可以通過RNase H Minus提升cDNA合成長(zhǎng)度。

5幾種代表性RT酶

常見代表性RT酶有HIV1 RTase、AMV RTase和MMLV RTase。其中，HIV1 RTase是研究最早、最透徹的RT酶；AMV RTase是源自禽成髓細(xì)胞瘤病毒 （禽源），該酶的RNase H活性強(qiáng)，合成長(zhǎng)度短，合成量低，熱穩(wěn)定性好（42～55℃）；MMLV RTase是源自莫洛尼鼠白血病病毒 （鼠源），該酶的RNase H活性弱，合成長(zhǎng)度長(zhǎng)，合成量高，熱穩(wěn)定性差（37～42℃）。

二．反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)策略

1常規(guī)反轉(zhuǎn)錄方法與優(yōu)化的反轉(zhuǎn)錄方法

常規(guī)的反轉(zhuǎn)錄體系需要把模板、引物、dNTP、反應(yīng)緩沖液、RNA 酶抑制劑和反轉(zhuǎn)錄酶等組分逐一加入同一PCR管，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

優(yōu)化的反轉(zhuǎn)錄體系（以我們公司AT321產(chǎn)品為例）就是在反應(yīng)時(shí)，只需加入模板RNA和水即可高效合成第一鏈cDNA。操作簡(jiǎn)便，降低操作過程中的污染機(jī)率。

常規(guī)的反轉(zhuǎn)錄程序需要1.5h，而優(yōu)化后的反轉(zhuǎn)錄程序只需要0.5h（for PCR），或者15min（for QPCR），這樣大大節(jié)約的時(shí)間。

2反轉(zhuǎn)錄效率的影響因素

RNA模板的品質(zhì)不好會(huì)對(duì)反轉(zhuǎn)錄效率造成一定的影響。

常用的反轉(zhuǎn)錄引物有Random primer、Oligo(dT) primer和Sequence-specific primer。

Random primer可以隨機(jī)與模板結(jié)合，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；Oligo(dT) primer與真核生物的mRNA的Poly（A）進(jìn)行有效地結(jié)合，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；Sequence-specific primer是針對(duì)特定基因設(shè)置的引物，多用于一步法熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。

當(dāng)反轉(zhuǎn)錄體系中加入引物是Oligo(dT) primer時(shí)，如果mRNA模板有些高級(jí)結(jié)構(gòu)，那么cDNA合成過程中就會(huì)受阻，mRNA上遠(yuǎn)離3’端的基因和高級(jí)結(jié)構(gòu)處的基因序列就無法獲得。若在前面的反轉(zhuǎn)錄體系中再加入Random primer，那么就可以獲得mRNA上遠(yuǎn)離3’端的基因，但是高級(jí)結(jié)構(gòu)處的序列仍無法獲得，這個(gè)在后面的內(nèi)容會(huì)詳細(xì)介紹。

反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)反轉(zhuǎn)錄效率影響主要包括RNase H活性、聚合酶活性的合成能力、RT酶保真性和熱穩(wěn)定性RT酶等等。

RNase H活性在前面內(nèi)容已有介紹，這里不再贅述；

聚合酶活性的合成能力主要取決于RT酶的動(dòng)力學(xué)范圍，它是指對(duì)不同濃度RNA模板的RT效率一致時(shí)，RNA模板的濃度范圍。因此，我們要選擇高品質(zhì)RT酶，這種RT酶的動(dòng)力學(xué)范圍寬廣，對(duì)低濃度RNA可以有效反轉(zhuǎn)，并且對(duì)高濃度RNA沒有抑制。

RT酶保真性低原因是缺乏3 ’-5’外切酶活性，那么我們可以在RT酶中加入具有3’-5’外切酶活性的蛋白，賦予其校正功能，實(shí)現(xiàn)高保真RT-PCR。

RT酶熱穩(wěn)定性提高，可以打開復(fù)雜模板中二級(jí)結(jié)構(gòu)，cDNA合成繼續(xù)，但是要求RT酶熱穩(wěn)定性高，這個(gè)問題可以通過點(diǎn)突變提高RT酶的熱穩(wěn)定性來解決。

3去除基因組的同時(shí)反轉(zhuǎn)錄

傳統(tǒng)去除gDNA的方法是使用DNase Ⅰ處理，隨后再對(duì)該酶進(jìn)行失火，操作繁瑣；我們公司目前研發(fā)出一款新的酶-gDNA Remover，可以有效地切割雙鏈DNA，但對(duì)單連DNA沒有作用；所以cDNA合成步驟和DNA去除步驟同時(shí)進(jìn)行，RTase失活和 gDNA Remover失活同時(shí)進(jìn)行。

4 microRNA（miRNA）的概述及檢測(cè)

microRNA在動(dòng)植物體內(nèi)廣泛存在，可以抑制特定基因表達(dá)，在表達(dá)調(diào)控中有重要作用；microRNA序列高度保守，長(zhǎng)度18 ～ 25 nt。 

microRNA檢測(cè)方法有Northern Blot、Micro array、Real-time RT-PCR（qRT-PCR）等。

其中，Real-time RT-PCR（qRT-PCR）實(shí)驗(yàn)方法可進(jìn)行高通量檢測(cè)，也可檢測(cè)微量miRNA；可區(qū)分前體miRNA與成熟miRNA；可區(qū)分單堿基差異；并且易于操作。

qRT-PCR檢測(cè)microRNA時(shí)，可通過miRNA特異引物和miRNA加尾法合成較長(zhǎng)的cDNA序列，方便后續(xù)基因的檢測(cè)。