【新手必讀】從RNA提取到qPCR：高品質(zhì)RNA模板制備

RNA作為DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，包括組成型RNA、表達(dá)型RNA和調(diào)節(jié)型RNA。RNA參與生物機(jī)體的重要生命活動，也是一直以來的研究熱點，如：疾病相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄組或表達(dá)譜的研究及科學(xué)研究相關(guān)基因的表達(dá)水平qPCR檢測。有關(guān)RNA的實驗，首先要獲得優(yōu)質(zhì)的RNA樣品，本文將會跟大家分享如何獲得高品質(zhì)的RNA。

01．RNA提取基本原則

RNA提取的基本原則是從目標(biāo)樣本中提取出完整度好、純度高的優(yōu)質(zhì)RNA，主要避免在樣品的保存或RNA提取過程中，RNase對RNA的降解。

02．樣品保存

拿到樣品后如不能立刻進(jìn)行提取，需要對樣品進(jìn)行液氮速凍，之后于-80℃保存；不建議直接將樣本放于-20℃亦或是-80℃進(jìn)行儲存，由于在緩慢降溫過程中，隨著細(xì)胞的死亡，細(xì)胞內(nèi)的溶酶體破裂，溶酶體內(nèi)的RNase會釋放出來使樣本中的RNA降解。

03．樣品保護(hù)

在沒有液氮的實驗條件下，如野外采樣等，不能對樣品立刻進(jìn)行速冷時，可以利用一些保護(hù)試劑如RNA hold對樣品進(jìn)行保存；其主要成分是非特異性蛋白酶變性劑，能夠失活樣本內(nèi)源性的RNase，從而保護(hù)RNA的完整性。

04．RNA提取方法選擇

拿到樣品后，需要根據(jù)樣品的種屬，如動物樣品或植物樣品；亦或是樣本狀態(tài)，諸如是動物組織或是動物細(xì)胞，進(jìn)行提取試劑和相應(yīng)提取方法的選擇。

RNA提取方法包括兩種：

一種是胍鹽法：其能夠有效裂解細(xì)胞，同時抑制RNase活性、保持RNA完整度；下游可用硅膠柱亦或是異丙醇進(jìn)行RNA富集，其特點是提取量大。提取試劑如：EasyPure RNA Kit；Viral DNA/RNA Kit；Plant RNA Kit；Blood RNA Kit。

另一種是CTAB法：其在裂解細(xì)胞時能夠避免多糖多酚與RNA的結(jié)合，同樣下游可用硅膠柱法亦或是異丙醇進(jìn)行RN·A富集，其主要適用于植物樣品尤其是多糖多酚類樣品RNA的提取。提取試劑如TransZol Plant。

05．RNA提取注意事項

實驗人員需要穿實驗服，佩戴手套和口罩亦或頭套，以防止皮屑、唾液及頭屑中RNase的引入；

提取RNA所用操作臺最好是專用的，或干凈的且人流量小的區(qū)域，以避免外源RNase的引入； 

RNA提取所用耗材如EP管或槍頭等需進(jìn)行DEPC處理（0.1%DEPC水浸泡過夜，高壓滅菌后烘干即可使用）以失活RNase，或購買RNase-free的耗材直接使用；提取時所用的有機(jī)試劑如70%乙醇需要用RNase-free水或0.1%的高壓滅菌的DEPC水進(jìn)行配置；

用于組織研磨的研缽，使用前需要用酒精灼燒，以失活研缽可能殘存的RNase；

提取RNA時所用的有機(jī)試劑如氯仿或異丙醇要與提DNA的分開使用，以避免外源RNase的引入；

整個提取過程在低溫條件下快速提取，以降低RNA降解的風(fēng)險。

06．RNA檢測

提取完RNA后需要對RNA進(jìn)行檢測，包括分光光度計、瓊脂糖凝膠電泳及Agilent’s RNA LabChip and 2100 Bioanalyzer分析等，以檢測RNA的濃度、純度和完整度。

分光光度計檢測：主要用于RNA的濃度及純度測定，不能進(jìn)行RNA完整度檢測。其兩個重要參數(shù)包括A260/280及A260/230；純度較好的RNA，A260/280為2.0左右，如果比值小于2.0，RNA中有蛋白殘留；A260/230為2.0-2.2之間，如果比值小于2.0，RNA中含有有機(jī)試劑，如酚、乙醇或糖類的殘留。

瓊脂糖凝膠檢測：可以進(jìn)行RNA完整度分析，但其不能對RNA實現(xiàn)準(zhǔn)確定量或是否有雜質(zhì)如有機(jī)試劑，如酚、乙醇或糖類的殘留進(jìn)行檢測。最終通過RNA條帶完整度來判斷RNA是否降解或有基因組（gDNA）殘留。

Agilent’s RNA LabChip and 2100 Bioanalyzer進(jìn)行RNA品質(zhì)分析：主要通過峰圖位置及峰圖高度或面積來分析RNA的完整度和濃度，同時可檢測RNA中是否有基因組（gDNA）的殘留；但其不能檢測RNA的純度即是否有蛋白或有機(jī)試劑污染。此檢測方法成本比較高，一般適用于對RNA質(zhì)量要求比較高的實驗，如二代或三代測序。

上述任一方法均不能同時檢測RNA的濃度、純度及完整度，需要使用其中任意兩種方法同時對RNA進(jìn)行分析，以保證RNA的品質(zhì)。

07．基因組（gDNA）去除

如果提取的RNA有gDNA殘留，需要去除gDNA以避免其對后續(xù)qPCR定量的影響，即使用DNaseⅠ消化去除。

DNaseⅠ活性嚴(yán)格依賴于Ca²⁺；在Ca²⁺存在條件下，如果反應(yīng)體系中含有Mg²⁺，DNaseⅠ會對gDNA進(jìn)行隨機(jī)切割，消化為小的DNA片段；如果體系中含有Mn²⁺，DNaseⅠ會特異性識別特定位點，將gDNA消化為長度不一的DNA片段。

EDTA、 SDS、DTT/β-ME、高鹽（>100 mM）等會嚴(yán)重影響DNaseⅠ活性。

08．DNaseⅠ失活

方法一：根據(jù)DNaseⅠ活性嚴(yán)格依賴于Ca²⁺這一特性，可在濃度為2.5 mM EDTA條件下，將含有DNaseⅠ的RNA 65℃加熱10 min，使DNaseⅠ失活。

方法二：DNaseⅠ作為蛋白，可利用酚氯仿進(jìn)行抽提去除。

通過上述一系列操作之后，即可得到無gDNA殘留、純度高且完整度好的RNA，以作為后續(xù)實驗的底物。