一．核酸抽提原理：

核酸抽提包含樣品的裂解和純化兩大步驟。其是：裂解樣品中的核酸游離在體系；純化游離的核酸，使之與體系中的其它成分分離（如蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)徹底分離）。

常用的裂解液：包括去污劑 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和鹽 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。

去污劑的作用，是通過使蛋白質(zhì)變性、破壞膜結(jié)構(gòu)、解開與核酸相連接的蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)核酸游離在裂解體系中。

鹽的作用，除了提供一個(gè)合適的裂解環(huán)境 (如 Tris)，還包括抑制樣品中的核酸酶在裂解過程中對(duì)核酸的破壞 (如 EDTA)、維持核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定 (如 NaCl) 等。

裂解體系中還可能加入蛋白酶，利用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成小的片段，促進(jìn)核酸與蛋白質(zhì)的分開，同時(shí)，也便于后面的純化操作以及獲得更純的核酸。也有直接使用高濃度的蛋白質(zhì)變性劑 (如 GIT、GuHCl 等) 裂解的，該方法已經(jīng)成為了 RNA 抽提的主流，卻不是基因組 DNA 抽提的主流。

二．最常用的純化方法

（一） PC 抽提（Phenol-chloroform extraction：酚氯仿抽提）+醇沉淀：利用PC對(duì)裂解體系進(jìn)行反復(fù)抽提以去除蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)核酸與蛋白質(zhì)的分離，再用醇將核酸沉淀下來(lái)，實(shí)現(xiàn)核酸與鹽的分離。

（二）介質(zhì)純化：利用某些固項(xiàng)介質(zhì)，在某些特定的條件下，選擇性地吸附核酸，而不吸附蛋白質(zhì)及鹽的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)核酸與蛋白質(zhì)及鹽的分離。

（三）高鹽沉淀去除蛋白質(zhì)是第一種純化方法的一個(gè)變體，省略了PC操作的麻煩，也有不純化的抽提方法，但是用途多局限于簡(jiǎn)單的 PCR。

三．裂解方法的評(píng)價(jià)

（一）含蛋白酶的裂解方法是抽提基因組 DNA 的首選。包括裂解游離的膜蛋白與基因組 DNA 相連接的游離蛋白質(zhì)。

（二）不使用蛋白酶的去污劑裂解方法，在細(xì)胞基因組 DNA 抽提方面仍然有優(yōu)勢(shì)。尤其是當(dāng)?shù)寐屎图兌纫蟛皇亲罡?，而?jīng)濟(jì)性及操作簡(jiǎn)單很重要時(shí)，控制好裂解液/樣品的比例是該方法成功的關(guān)鍵。該方法結(jié)合高鹽沉淀，可以實(shí)現(xiàn)最簡(jiǎn)單的操作，但純度及得率的穩(wěn)定性可能會(huì)比用 PC 抽提的差一些。

（三）高濃度蛋白質(zhì)變性劑 (如 GIT、GuHCl 等) 的裂解方法是抽提 RNA 的首選。

（四）含 CTAB 的裂解液，幾乎成為富含多糖的樣品，如細(xì)菌、植物的基因組 DNA 抽提的首選裂解方法。

（五）SDS 堿裂解法是質(zhì)粒抽提的首選裂解方法，具有快速、得率高、幾乎無(wú)基因組 DNA 污染的特點(diǎn)。

（六）PCR 模板的簡(jiǎn)易裂解方法，也是使用面很廣的一類方法。該方法的特點(diǎn)是無(wú)須純化，樣品被裂解后即可直接取裂解液用于 PCR，非?？焖?。

四．純化方法的評(píng)價(jià)

（一）PC 抽提/醇沉淀方法：穩(wěn)定、可靠、經(jīng)濟(jì)、方便。PC 抽提可以徹底去除蛋白質(zhì)，醇沉淀可以去除鹽，對(duì)于一般的干凈的樣品 (雜質(zhì)為蛋白質(zhì))，該方法完全可以獲得高質(zhì)量的核酸。

（二）高鹽沉淀蛋白質(zhì)/醇沉淀方法：同樣也是一個(gè)非常不錯(cuò)的方法。與 PC 抽提方法相比，除了純度的穩(wěn)定性可能要低一點(diǎn)外，該方法幾乎克服了 PC 抽提的所有缺點(diǎn)。更快、更輕松去除蛋白質(zhì)所伴隨的好處是，可以用于大規(guī)模抽提，不足是純度 (蛋白質(zhì)殘留) 不夠穩(wěn)定。

（三）介質(zhì)純化方法：是一個(gè)越來(lái)越受到重視的方法。其最大特點(diǎn)是非常適合大規(guī)模核酸抽提，并且因?yàn)槭苋藶椴僮饕蛩赜绊懶?，純度的穩(wěn)定性很高 (雖然純度不一定比PC 純化方法更高)。其致命弱點(diǎn)是樣品過量。介質(zhì)可以分為兩大類，一類是柱式的，即介質(zhì)被預(yù)先裝填在下面是通的柱子里；另外一類則是顆粒狀 (如Glassmilk、磁性小珠等)。

五．醇的沉淀

醇的沉淀，目的是使核酸從裂解體系中沉淀下來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)核酸與其它雜質(zhì)（主要是鹽）的分離。實(shí)際操作中，許多雜質(zhì)也會(huì)與核酸一起被醇沉淀下來(lái)，尤其是當(dāng)其它雜質(zhì)的濃度也比較高的時(shí)候。醇的沉淀并不是非常特異性的，任何有機(jī)大分子及一些鹽，當(dāng)濃度達(dá)到一定水平后，都可能同步被沉淀下來(lái)。最有參考價(jià)值的是 TRIzol 提供的一個(gè)沉淀方案：一半異丙醇加一半高鹽溶液替代純粹的異丙醇，可以大大降低多糖殘留。

PEG、LiCl、CTAB 都可以用于核酸沉淀。雖然它們遠(yuǎn)沒有醇沉淀的高使用頻率，但卻各有特點(diǎn)。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA，CTAB 可以從含多糖的裂解體系中將核酸沉淀下來(lái)。PEG 是沉淀病毒顆粒的方便手段。

六．洗滌

洗滌首先一定要將沉淀懸浮起來(lái)；第二就是要有一定的時(shí)間，尤其是當(dāng)核酸沉淀比較大時(shí) (使核酸沉淀最終蓬松)；第三是少量多次；第四則是去上清要徹底。

七．核酸質(zhì)量的檢測(cè)問題

目前用于正式實(shí)驗(yàn)前檢測(cè)核酸質(zhì)量的方法，一是電泳，二是紫外分光光度儀。

（一）電泳檢測(cè)的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大 (超出電泳分離范圍)，電泳還可以用于估計(jì)核酸的濃度，但其準(zhǔn)確度與經(jīng)驗(yàn)有關(guān)；另外，電泳也可能提供某些雜質(zhì)污染的信息。

（二）紫外分光光度儀檢測(cè)的是純度和核酸含量，該儀器的靈敏度非常高，A230 : A260 : A280 = 1 : 2 (DNA 為 1.8) : 1 為理論上的數(shù)據(jù)，實(shí)際測(cè)定時(shí)會(huì)有一些差別；但如果差別太大，就有問題了。 如： A260/A230 > 2 就是純的，如果 A260/A280 > 2.3 就是核酸降解，A260/A230比2大許多，一定是有雜質(zhì)殘留的。

八．核酸的溶解和保存

純化后的核酸，最后多使用水或者低濃度緩沖液溶解；其中 RNA 以水為主，DNA 則多以弱堿性的 Tris 或者 TE 溶解。經(jīng)典的 DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解，認(rèn)為 EDTA 可以減少 DNA 被可能殘留下來(lái)的 DNase 降解的風(fēng)險(xiǎn)；如果操作過程控制得當(dāng)，DNase 的殘留幾乎是可以忽略的，完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA。

實(shí)驗(yàn)室常用保存方法: -20℃保存的 DNA， -70℃保存的RNA。